2 结果与讨论

2.1 COS的酶法酶法制备

考察酶解时问、加酶量对壳聚糖酶酶解的制备肿瘤影响。如图1所示，壳寡还原糖生成量随酶解时问延长而上升。糖及酶解4h内，其抗还原糖含量快速增加，活性4h之后趋于平稳，酶法最佳酶解时问选定4h。制备肿瘤南图2可知，壳寡酶解过程中，糖及还原糖生成量随着加酶量的其抗升高而逐渐增大。在加酶量为120U/g时，活性还原糖生成量近最大值后稳定。酶法继续增加酶量未能使还原糖质量浓度显著增加。制备肿瘤最优加酶量选择为120U/g。壳寡

对酶解液逐步采用乙醇沉淀、超滤、纳滤进行分级分离，工艺流程如图3，最终得到COS产物，得率约41％。

2.2 COS组成分析

采用LC-MS法分析COS产物组成。液相色谱图中对应3个保留时问有吸收峰(见图4(a))，分别是5.21、6.90、8.36min。分别对其进行质谱分析，在ESI⁺模式下，质荷比m/z341.1、363.1(见图4(b))对应[壳二糖+H]⁺、[壳二糖+Nal⁺的分子离子峰，502.2、524.2(见图4(c))对应[壳三糖+H]⁺、[壳三糖+Nal⁺的分子离子峰，663.3、685.3(见图4(d))对应[壳四糖+Hl⁺、[壳四糖+Na]⁺的分子离子峰。依此判断所得COS产物的主要组分为壳二糖、壳三糖和壳四糖。进一步通过峰面积积分计算可知.所得COS组分中壳二糖、壳三糖和壳四糖相对含量的比例约为3:5:2。

通过自行构建的壳聚糖酶酶解，以及多级分级处理工艺获得了低相对分子质量的COS，为后续抗肿瘤活性的分析提供了更为明确和简单的物质基础。

2.3 COS抗肿瘤作用评价

2.3.1 COS对不同肿瘤细胞的抑制活性

研究COS对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人胰腺癌细胞PATU-899生长的影响(见图5)。在给药质量浓度0～1000μg/mL情况下，未观察到3株肿瘤细胞有生长抑制现象，可以认为低质量浓度的COS对肿瘤细胞生长影响甚微。

类似的结果在前期A549和HCT-116细胞的研究中也有报道。4种来源不同的COS作用时，高质量浓度(1.25～20mg/mL)明显抑制细胞增长，而低质量浓度(0.078125～1.25mg/mL)呈现负抑制作用。

其中相对分子质量在1500～2000的COS样品即使在高质量浓度(1.25～20mg/mL)下对A549细胞依然无细胞毒性。综观已报道的研究结果，多数报道可显著抑制细胞生长的研究巾使用的COS质量浓度较高，如相对分子质量1000～3000的COS在质量浓度5.0mg/mL时对MDA-MB-231细胞抑制效果最佳；2～5mg/mL的COS对HepG2细胞抑制率有剂量依赖关系。COS的肿瘤抑制活性因自身相对分子质量、给药质量浓度以及评价用细胞株的不同而各异，因此有必要进行更为细致地考察和分析。

2.3.2 COS联合DOX对不同癌细胞的抑制活性

近期研究发现，在多株骨肉瘤细胞巾，甘露糖与DOX或顺铂联，用可通过下调Bcl-2家族的Mcl-1和Bcl-X_L蛋白质表达水平而增强肿瘤细胞内在凋亡途径，提高抗肿瘤作用。DOX是治疗乳腺癌、肝癌等实体瘤的一种常用化疗药物。DOX的非靶向性可对正常细胞造成损伤。因此，新的方案建议可与其他药物或天然产物联用降低用药量以减少其副作用。受此启示，将COS与DOX复合给药以评价其效果。如图6所示，相较于DOX组50％的细胞生存率，COS仅在人乳腺癌细胞MDA-MB-231上表现出增强DOX抑制作用的效果，且在较低质量浓度下细胞生存率可下降20％～30％。由此选定MDA-MB-231细胞为后续实验的模型，进一步探讨复合给药的效果和机制。
 

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